蛋白提取论文(蛋白提取实验步骤)

1. 蛋白提取实验步骤

1

取适当相应蛋白高表达的动物组织提 total-RNA。

2

设计蛋白表达引物。 引物要去除信号肽， 要加上适当的酶切位点和保护碱基。

3

RT-PCR， KOD 酶扩增获取目的基因 c DNA.

4

双酶切， 将 cDNA.克隆入 PET28/32 等表达载体。

5

转化到 DH5α 感受态细菌中扩增， 提质粒。

2. 提取蛋白用到的实验试剂有什么

(1)破碎前向细胞悬浮液中加入双水相试剂；(2)将步骤(1)获得的混合液直接通入珠磨机进行破碎；

(3)破碎后从匀浆形成的双水相体系直接分离蛋白质。

其中的双水相试剂包括聚乙二醇+无机盐或聚乙二醇+葡聚糖，本方法优选聚乙二醇+无机盐作为双水相试剂；其中的无机盐优选磷酸盐和硫酸盐。

本方法在细胞破碎的同时加入双水相试剂对目标产物进行萃取，聚乙二醇与无机盐或聚乙二醇与葡聚糖的加入量应根据目标产物的性质及在双水相中的分配行为确定。在细胞破碎前加入双水相萃取液，由于混合过程中的局部盐浓度过高发生在细胞外，因此不会对胞内的目标产物有影响；并且在细胞破碎过程中，利用珠磨机内细胞破碎过程中良好的破碎条件使双水相试剂在细胞悬浮液中均匀分布，同时双水相试剂中的聚乙二醇可对目标产物的活性进行保护。利用珠磨机进行破碎的过程中，操作条件包括搅拌浆转速或浆叶的线性速率，玻璃珠粒径，破碎时间，破碎液的温度及在连续破碎的条件下破碎液的体积流量等。具体破碎条件的确定应根据目标产物的稳定性及目标产物在胞内的具体位置进行选择。在匀浆形成的双水相体系中，目标产物富集在富聚乙二醇相，细胞碎片的分布在另一相。收集含有目标产物的富聚乙二醇相以进行后续目标产物的纯化。

另外，采用过程集成的措施，对初级分离目标产物的各个生化单元操作步骤进行优化，既可降低珠磨机内剪切作用对目标产物的破坏，提高目标产物的稳定性；又缩短了细胞破碎时间，提高了破碎效率。本发明提供的方法是一种生产成本低，操作工艺简单的提取胞内产物的初级分离方法。

3. 蛋白提取实验步骤图

白蛋白是在血清提取物，属于血制品。白蛋白是人体必须的重要的蛋白质，对于人体细胞的代谢，胶体渗透压起到非常重要的作用。正常情况下，人体的蛋白由肝脏合成。提取人血白蛋白，是在正常健康人群的血液提炼出来的为临床应用。健康的人体，通过摄入适当的含有蛋白比较高的食物，通过肝脏合成，足够人体的需求，不需要进行白蛋白的血制品的应用。

4. 提取蛋白的试剂

地龙蛋白是从地龙胆（即龙胆）植物的根茎中提取出来的一种植物蛋白质。一般来说，地龙蛋白的提取过程包括以下步骤：

采集龙胆植物，通常在春季至初夏时期采摘。

对龙胆根茎进行清洗和切碎处理。

用溶剂（如乙醇或丙酮）将蛋白质从植物组织中提取出来，形成提取液。

利用离心、过滤等分离和纯化技术，将提取液中的地龙蛋白分离出来。

根据需要，可以对地龙蛋白进行进一步的提纯、结晶和干燥等处理，得到高纯度的地龙蛋白。

总之，地龙蛋白的提取和分离过程需要采用一系列复杂的分离和纯化技术，并需要特殊的设备和试剂来完成。

5. 蛋白提取的原理

①洗涤红细胞获取较纯净的红细胞原理；通过离心将密度不同的物质分离低速离心，去除上清液，反复加生理盐水并离心直到上清液未呈现黄色为止②释放血红蛋白 破裂红细胞，释放血红蛋白原理；低渗溶液中红细胞破裂；甲苯溶解膜脂，加速细胞破裂（相似相溶原理）加蒸馏水，再加甲苯，磁力搅拌器充分搅拌无明显现象③分离血红蛋白溶液初步得到血红蛋白溶液原理；通过离心将密度不同的物质分离离心（较高速）试管溶液分为4层④透析去掉液体中的小分子物质原理；小分子物质容易透出透析袋透析（12小时）透析袋中物质的颜色更红

6. 蛋白质提取实验

原理：

要进行重组DNA 实验,就离不开外源基因的纯化,而外源基因主要来源之一就要直接从生物的染色体DNA上制备,所以制备高质量的染色体DNA样品经常为基因工程实验所需要,抽提细菌染色体DNA的方法目前已有许多种,这里所介绍的两种方法：一适用于枯杆菌染色体的抽提；另一种方法则适用于大肠杆菌染色体的制备.

基因工程实验所需要的基因组DNA 通常要求分子量尽可能大,以此增加外源基因获得率,但要获得大片段的DNA 非易事,细菌基因组DNA通常是个很大的环状态DNA,而在抽提过程中,不可避免的机械剪切力必将切断DNA,如果要抽提到大的DNA 分子,就要尽可能地温和操作,减少剪切力,减少切断DNA 分子的可能性；分子热运动也会减少所抽提到的DNA分子量,所以提取过程也要尽可能在低温下进行.另外细胞内及抽提器皿中污染的核酸酶也会降解制备过程中的DNA,所以制备过程要抑制其核酸酶的活性.

另外制备的细菌染色体DNA 必须是高纯度的,以满足基因工程中各种酶反应的需要,制备的样品必须没有蛋白污染,没有RNA,各种离子浓度应符合要求,这些在染色体制备时都应考虑到.

大肠杆菌染色体DNA 抽提首先收集对数生长期的细胞,然后用离子型表面活性剂十二烷基磺酸钠（SDS）破裂细胞,SDS 具有的主要功能是：（1）溶解细胞膜上的脂类和蛋白质,因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜；（2）解聚细胞膜上的脂类和蛋白质,有助于消除染色体DNA上的蛋白质；（3）SDS 能与蛋白质结合成为R1—0—SO3R2—蛋白质的复合物,使蛋白质变性而沉淀下来.但是SDS 能抑制核糖核酸酶的作用,所以在以后的提取过程中,必须把它除干净.以免影响下一步RNase的作用.破细胞后RNA经RNase消化除去,蛋白质经苯酚、氯仿:异戊醇抽提除去经洒精沉淀回收DNA.枯草杆菌染色体制备与上类似,但略加修改的方法要适合教学要求.枯草杆菌是格兰氏阳性菌,所以在SDS 处理前需要使用溶菌酶裂解细胞壁.溶菌酶是一种糖苷水解酶,它能水解菌体细胞壁的主要化学成份肽聚糖中的β—1,4 糖苷键,有助于细胞壁破裂,破裂的细胞壁在SDS 的作用下溶菌,同时用蛋白酶K 消化蛋白质,能解离缠绕在染色体DNA上的蛋白质,然后加入一定量的醋酸钾,使蛋白质变性,通常离心除去,在这期间可加入核糖酸酶消化RNA,最后用乙醇回收DNA.

此二种方法抽提的细菌染色体DNA,无RNA和蛋白质污染,可用于限制性内切酶消化,分子再克隆等.但在下一步实验前,要测定其DNA的浓度,常用测定DNA 浓度的方法,是溴化乙锭电泳法；当DNA 样品在琼脂糖凝胶中电泳时,加入的EB 会增强发射的荧光.而荧光的强度正比于DNA 的含量,如将已知浓度的标准样品作电泳对照,就可估计出待样品的浓度。

7. 提取蛋白质实验设计

蛋白质的分离纯化方法

2.1根据分子大小不同进行分离纯化

蛋白质是一种大分子物质,并且不同蛋白质的分子大小不同,因此可以利用一些较简单的方法使蛋白

质和小分子物质分开,并使蛋白质混合物也得到分离。根据蛋白质分子大小不同进行分离的方法主要有透析、超滤、离心和凝胶过滤等。透析和超滤是分离蛋白质时常用的方法。透析是将待分离的混合物放入半透膜制成的透析袋中,再浸入透析液进行分离。超滤是利用离心力或压力强行使水和其它小分子通过半透膜,而蛋白质被截留在半透膜上的过程。这两种方法都可以将蛋白质大分子与以无机盐为主的小分子分开。它们经常和盐析、盐溶方法联合使用,在进行盐析或盐溶后可以利用这两种方法除去引入的无机盐。由于超滤过程中,滤膜表面容易被吸附的蛋白质堵塞,以致超滤速度减慢,截流物质的分子量也越来越小。所以在使用超滤方法时要选择合适的滤膜,也可以选择切向流过滤得到更理想的效果

离心也是经常和其它方法联合使用的一种分离蛋白质的方法。当蛋白质和杂质的溶解度不同时可以利用离心的方法将它们分开。例如,在从大米渣中提取蛋白质的实验中,加入纤维素酶和α-淀粉酶进行预处理后,再用离心的方法将有用物质与分解掉的杂质进行初步分离[3]。使蛋白质在具有密度梯度的介质中离心的方法称为密度梯度(区带)离心。常用的密度梯度有蔗糖梯度、聚蔗糖梯度和其它合成材料的密度梯度。可以根据所需密度和渗透压的范围选择合适的密度梯度。密度梯度离心曾用于纯化苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白,得到的产品纯度高但产量偏低。蒋辰等[6]通过比较不同密度梯度介质的分离效果,利用溴化钠密度梯度得到了高纯度的苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白。凝胶过滤也称凝胶渗透层析,是根据蛋白质分子大小不同分离蛋白质最有效的方法之一。凝胶过滤的原理是当不同蛋白质流经凝胶层析柱时,比凝胶珠孔径大的分子不能进入珠内网状结构,而被排阻在凝胶珠之外,随着溶剂在凝胶珠之间的空隙向下运动并最先流出柱外;反之,比凝胶珠孔径小的分子后流出柱外。目前常用的凝胶有交联葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶等。在甘露糖蛋白提纯的过程中使用凝胶过滤方法可以得到很好的效果,纯度鉴定证明产品为分子量约为32 kDa、成分是多糖∶蛋白质(88∶12)、多糖为甘露糖的单一均匀糖蛋白[1]。凝胶过滤在抗凝血蛋白的提取过程中也被用来除去大多数杂蛋白及小分子的杂质[7]。

8. 蛋白提取实验步骤是什么

抽提试验是一种重要的化学分析方法，常用于分离和检测样品中微量有机物、无机物或生物大分子等。抽提试验的检查方法和意义如下：

检查方法：

1. 选择合适的抽提试剂和条件，将样品与试剂混合，使目标物质转移到试剂中。

2. 分离试剂和物质，通常使用离心、蒸发、萃取等方法。

3. 对分离后的试剂进行进一步的检测和分析，如色谱、质谱、光谱等方法。

意义：

1. 抽提试验可以分离和富集样品中的目标物质，从而提高检测灵敏度和准确性。

2. 抽提试验可以去除或减少干扰物质的影响，提高检测的特异性和选择性。

3. 抽提试验可以将样品中的目标物质转化为易于检测的形式，如转化为染色体、荧光化合物等。

4. 抽提试验可以用于样品前处理，如去除样品中的杂质、浓缩样品等。

需要注意的是，抽提试验是一种有选择性和特异性的分析方法，需要根据样品的性质和分析目的选择合适的试剂和条件，以避免误差和干扰。同时，抽提试验还需要严格的实验控制和质量保证，以保证数据的可靠性和准确性。

9. 大鼠肾脏皮质总蛋白提取实验步骤

蛋白质的提取和分离一般分为四步：

(1)样品处理：包括洗涤红细胞;血红蛋白稀释;离心等操作收集到的血红蛋白溶液。

(2)粗分离：透析除去分子较小的杂质。

(3)纯化：通过凝胶色谱法将分子量较大的杂质蛋白质除去。

(4)纯度鉴定：通过聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定

10. 蛋白提取实验报告

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